Agnes Rogala er mikrobiolog og i doktorgradsprosjektet har hun kombinert fagomr?dene biomaterialer, cellebiologi og mikrobiologi.
– Vi hadde to m?l med dette prosjektet, sier hun.
– Det f?rste var ? bedre festemulighetene for celler og integreringen med vevet i munnhulen. Det andre var ? forhindre bakterieinfeksjon. Vi studerte hvordan modifisere titanimplantater for ? bedre integreringen med vevet i munnen. Overflaten av tannimplantatet dekket vi med tanninsyre, som er et polyfenol som bl.a. finnes i te, sjokolade, kaffe og i bl?b?r, og er et naturlig middel. Stoffet har antibakterielle og antioksidante egenskaper. Bakterieinfeksjoner er den vanligste formen for komplikasjoner etter ? ha f?tt satt inn implantat i munnen, og det vil vi unng?.
Tanninsyre endret cellenes festeevne
Studien unders?kte hvordan celler i tannkj?ttet og i kjevebeinet festet seg til overflaten p? et tannimplantat av titan. Samtidig besto oppgaven i ? sjekke om bakterier ogs? festet seg til den modifiserte overflaten. I det f?rste steget av studien unders?kte man hvordan proteinene fra blod festet seg til overflaten. Det f?rste som skjer n?r man setter et implantat inn i munnhulen, er at det kommer i kontakt med ulike proteiner fra spytt, fra blod osv. ? teste hvordan disse proteinene fester seg til en tanninsyrebehandlet overflate var vesentlig. Et av funnene var at denne tilf?rselen er annerledes enn ved en ubehandlet implantatoverflate. Overflaten var endret, og cellenes festeevne var ogs? endret.
– Vi hadde en hypotese om at overflatebehandling med tanninsyre ville bedre cellenes festeevne, men det vi hadde forventet skjedde ikke. Cellene ville ikke feste seg i det hele tatt p? dette proteinlaget. Uten proteinlaget hadde de festet seg perfekt til overflaten, og trivdes p? overflaten.
N?dvendig med ytterligere overflatemodifikasjon
Det er alltid proteiner p? overflaten av tannimplantater f?r cellene slipper til. I det videre arbeidet med studien ville Agnes endre overflatebehandlingen med tanninsyre ytterligere for ? ?ke sjansene for et mer ?nsket utfall. Tanninsyre er et molekyl som har god reaksjonsevne med andre stoffer som proteiner, sakkarider og metallioner osv.
– Vi visste at patogene bakterier fester seg godt til tanninsyrebehandlete overflater, sier hun.
Derfor ville de legge et annet materiale opp?, som reduserte de d?rlige egenskapene til tanninsyre. Men som samtidig bedret cellenes festeevne, og reduserte bakterienes festeevne.
– Vi dekket titanimplantatets overflate med tanninsyre som tidligere, men vi tilf?rte probiotiske bakterier p? det ?verst laget. Probiotiske bakterier er bra, s? vi ville ha et tett lag. Det er gode bakterier, som du kan finne nesten overalt. I munnen, i tarmen, i urinveiene osv. Vi valgte en streng som kan feste seg til ulike overflater og danne biofilm.
– Og den produserer noen antibakterielle virkestoffer. Selv om de er bakterier, kan de fortsatt produsere antibakterielle virkestoffer som dreper andre sykdomsfremkallende bakterier.
Cellene produserte beinkrystaller
De tanninsyremodifiserte overflatene ble dekket med probiotikabakterien Lactobacillus crispatus. Men probiotikaen p? overflaten kan ikke v?re levende n?r implantatet settes inn, s? cellene m?tte inaktiveres (?drepes?). Et veldig fint lag med probiotika ble inaktivert. For selv i sin inaktive form har probiotika fortsatt fordelaktige og helsefremmende egenskaper.
Rogala testet overflatene med celler. Hvordan de interagerte med overflaten og med patogene bakterier. Hun testet ogs? hvordan cellene festet seg til og oppf?rte seg p? overflatene. Og om disse overflatene var i stand til ? forhindre patogene bakterier i ? feste seg.
– Vi fikk lovende resultater. Cellene trivdes veldig godt p? overflatene. Vi observerte at de festet seg, de vokste, de formerte seg og s? videre. Cellene ble ogs? mineralisert. Det er det vi ?nsker n?r vi legger implantater i bein. Vi vil ha celler som produserer beinkrystaller og som integreres med bein. De gjorde det p? de probiotisk dekkede overflatene, og det var bra.
Test med sykdomsfremkallende bakterier
Men det var ogs? n?dvendig ? teste om overflatene hadde antimikrobielle egenskaper. Den patogene bakterien Staphylococcus epidermidis ble brukt til det form?let.
– Det er en bakterie vi har p? huden, men n?r en pasient med nedsatt immunforsvar f?r satt inn et implantat, s? har vi en situasjon der immunresponsen ikke fungerer s? bra i forbindelse med en skade. I slike tilfeller kan denne bakterien for?rsake betennelse, sier Agnes.
Den patogene bakterien ble tilsatt p? overflaten, da det var et tynt lag av probiotika, s? de d?rlige bakteriene fremdeles kunne feste seg og kolonisere overflaten. Men med veldig tykke, fine lag med probiotika, kunne ikke de patogene bakteriene feste seg. De forhindret dermed infeksjonen i ? utvikle seg.
– Dette er en ganske ny metode. S? langt har jeg bare kunnet finne tre studier om probiotisk overflatemodifisering, og den f?rste artikkelen ble gitt ut i 2018. Tiln?rmingen er ganske ny, spesielt med probiotika, og den har veldig lovende resultater, forteller Agnes.
Metoder og teknikker – QCM-D
Teknikkene studien brukte er ganske kompliserte.
.jpg)
Maskinen QCM-D er en forkortelse for Quartz Crystal Microbalance with Dissipation. Veldig enkelt sagt, s? kan man med denne metoden f.eks. overv?ke implantatoverflaten n?r man injiserer tanninsyre-l?sning i sanntid: Hvor raskt molekylene adsorberer p? overflaten, og hvor tykt laget av tanninsyre blir. Den samme monitoreringen ble gjort med proteiner n?r de ble injisert p? implantatoverflaten. Med QCM-D kunne man overv?ke hvor raskt proteinene ble adsorbert, og hvor tykt proteinlaget var.
Ved ? bruke denne metoden kan man ogs? registrere i sanntid hvordan cellene fester seg til overflaten. Med QCM-D-metoden f?r man egentlig bare tall som man lager en kurve ut fra. Formen p? kurven gir informasjon om laget som har dannet seg p? overflaten. Studien observerte at celler responderte annerledes p? tanninsyrelaget enn til en overflate som ikke var dekket med tanninsyre, men de visste ikke hva cellene faktisk gj?r. Hvordan oppf?rer de seg p? overflaten?
Rogalas prosjekt kombinerte QCM-D-metoden med konfokalmikroskopi. Sistnevnte gj?r det mulig ? lage optiske snitt med h?y oppl?sning og kontrast. Denne teknikken gj?r det mulig ? rekonstruere tre-dimensjonale strukturer med h?y detaljrikdom.
QCM-D og konfokalmikroskopi
– Vi lagde en video av hva cellene gj?r p? overflaten, forteller Agnes.
Prosjektet kombinerte QCM-D med bilder av levende celler. Det inneb?rer at man farger de humane cellene n?r man ser dem p? overflaten og tar bilder hvert 15. minutt, for ? se om de fester og sprer seg p? overflaten. M?let var ? se om cellene var levende n?r eksperimentet ble gjennomf?rt eller ikke.
– Vi s? forskjeller i hvordan cellene oppf?rte seg p? overflater dekket med tanninsyre og overflater som ikke var dekket. F. eks. n?r vi hadde mange proteiner p? en overflate som var dekket med tanninsyre, s? kunne ikke cellene feste seg i det hele tatt. De bare beveget seg frem og tilbake, og kunne ikke spre seg. Men n?r vi hadde dekket overflaten med tanninsyre uten proteiner, s? spredte cellene seg s? fort vi injiserte dem. Tanninsyre oppf?rer seg som lim, men n?r vi tilsetter et proteinlag p? tanninsyre, s? oppf?rer cellene seg som om de er forvirret, og ikke vet hva de skal gj?re. Da observerte vi ogs? litt h?yere d?dstall blant cellene, sier Agnes.
– Vi farget ogs? cellene ved at vi inaktiverte og p? en m?te ?drepte? cellene p? implantatoverflaten. Ved ? farge cellene kan man se hvordan cellene ser ut. Om de sprer seg fint og hvilken form de har.
I neste steg brukte Rogala en annen metode som heter ELISA for ? beskrive celleprosessene i prosjektet. Denne metoden brukes for ? kvantifisere proteinene i cellene.
– Vi brukte denne metoden, for ? beskrive hvordan humane celler sprer seg. ELISA brukes til ? overv?ke mange ulike prosesser i cellene, ikke kun spredning. De danner tynne utl?pere som ligner fingre eller en h?nd, s?kalte filopodier. I enden av hver filopodi danner cellen sm? adhesjonsstrukturer som fester seg til underlaget, men ikke overalt – bare p? utvalgte punkter.
– S? vi ville kvantifisere en av proteinene i filopodia, for ? se hvor sterkt de knytter seg til overflaten. Og vi s? at det p? tanninsyredekket overflate var mindre av dette proteinet enn p? udekket titanoverflate. Det betyr at tanninsyre er et slags forstyrrelsesmiddel.
UV-lys inaktiverer bakteriene
Celleeksperimentene er gjort p? 澳门皇冠体育,皇冠足球比分slaben p? Institutt for klinisk odontologi. For ? unders?ke bakterienes p?virkning p? titanoverflatene jobbet Agnes Rogala i Fernanda Petersens lab p? IOB. Og der fikk hun tilgang p? b?de probiotiske bakterier og patogene bakterier. Pr?vene med dekkede titanoverflater hadde Rogala forberedt p? forh?nd, for det er ikke lov til ? jobbe med bakterier p? 澳门皇冠体育,皇冠足球比分slaben.
– Vi inaktiverte eller ?drepte? cellene med UV-lys, s? de ikke var ?levende? lenger.
– Det samme ble gjort med bakteriene, for vi ?nsket ikke ? f? immunrespons p? probiotika p? implantater. S? vi inaktiverte bakteriene, og s? tok jeg titanflatene med meg tilbake til 澳门皇冠体育,皇冠足球比分slaben. Der s? jeg p? cellene og utf?rte eksperimenter p? hvordan cellene reagerte p? overflatene dekket med de ulike lagene.
– Eksperimentet med ? teste for antibakterielle aktiviteter mot bakteriene gjorde jeg p? IOB. S? jeg utf?rte de samme eksperimentene som jeg hadde gjort med cellene. Vi p?f?rte et lag med probiotiske bakterier, og inaktiverte bakteriene med UV-lys. Og s? la vi p? patogene bakterier, og vi unders?kte om de festet seg til overflaten eller ikke.
Hvorfor er denne forskningen viktig?
– Det er viktig fordi forskere p? biomaterialer tester mange ulike overflatemodifiseringer. Med prosjektet mitt ville vi kombinere og lage et multifunksjonelt belegg som b?de fremmer integrering og forhindrer bakterieangrep. Men vanligvis er disse variantene monofunksjonelle. Det betyr at de enten bedrer integrasjonen med implantater, bygger vev, eller de forhindrer bakterieinfeksjon. De bidrar ikke til denne todelte aktiviteten. Basert p? faglitteraturen kan tanninsyre gj?re begge deler. Og vi fikk lovende resultater. Jeg tror ikke tanninsyre som overflatemodifisering fungerer som antibakterielt middel enn?. Det er en hypotese, som m? modifiseres ytterligere, men det er i s? fall et annet PhD-prosjekt, avslutter Agnes.
Referanser
- Rogala, Agnes; Tiainen, Hanna & Zaytseva-Zotova, Daria (2024). Using QCM-D for Real-Time Analysis of Cell Adhesion Dynamics at Biointerfaces. Advanced Materials Interfaces. ISSN 2196-7350. doi: 10.1002/admi.202400811.
- Rogala, Agnes; Zaytseva-Zotova, Daria; Oreja Remartinez, Enrique; Barrantes Bautista, Alejandro & Tiainen, Hanna (2024). Combining QCM-D with live-cell imaging reveals the impact of serum proteins on the dynamics of fibroblast adhesion on tannic acid-functionalised surfaces. Biomaterials Science. ISSN 2047-4830. 12, s. 3345– 3359. doi: 10.1039/d4bm00184b?.